domingo, 19 de mayo de 2019

prueba de Reacción en Cadena de la Polimerasa para Rotavirus




Tema: “Diversidad de Rotavirus A en niños con gastroenteritis aguda en Lima, Perú”

Objetivo: Determinar la frecuencia de Rotavirus A en muestras e Identificar los genotipos de Rotavirus A presentes en las muestras positivas mediante la amplificación de los genes VP7 (G) y VP4 (P) por RT-PCR.

Muestra: heces provenientes de una población infantil con gastroenteritis aguda

Gen a amplificar: VP7 (G) y VP4 (P)

ADN: ARN viral

Extracción de ADN: El ARN viral de doble cadena se extrajo con el kit de extracción QIAmp Viral RNA de Qiagen (Catalog #52904/6)

Tipo de PCR: qRT-PCR

Procedimiento:

Se preparó un pre mix con los cebadores, añadiendo 2 μl por reacción de 20 μM NVP3- FDeg y 2 μl por reacción de NVP3-R1.

Posteriormente se añadieron 2 μl de ARN a la mezcla de cebadores.

La mezcla se desnaturalizó en un termociclador a 97°C por 5 minutos.

Se preparó el master mix usando el Kit QuantiTect® Probe RT-PCR (QIAgen Catalog # 204443). Posteriormente, se agregaron los 6μl del mix ARN y cebadores a los tubos con el master mix.

Se colocaron los tubos en el termociclador (Lighcycle™ 96) y se realizó el siguiente perfil de ciclos: 45 ciclos de 95ºC por 15 segundos y 1 minutos a 60ºC.

Hibridación: 30  segundos 50ºC

Elongación: 15 segundos a 95ºC

Visualización:  fluorescencia por resonancia (FRET)

Conclusión: Rotavirus estuvo presente en el 10% de las muestras analizadas mediante el test de qRT-PCR. El 62.2% de los casos positivos se presentó entre niños, mientras que el 37.78% de niñas obtuvo resultados positivos; no existiendo diferencia significativa. En el presente estudio, se reporta por primera vez en el Perú la presencia del genotipo G12P[8] perteneciente al linaje III.


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